Эффектом памяти для иммобилизации цефазолина, методом малоуглового рассеяния нейтронов

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ

ЭФФЕКТОМ ПАМЯТИ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЦЕФАЗОЛИНА,

МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ

Ю. В. Кульвелис^{1, 2}, В. Т. Лебедев¹, В. А. Трунов¹, С. С. Иванчев³, О. Н. Примаченко³, С. Я. Хайкин<sup>3

1</sup>Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН,

Гатчина, Ленинградская область, Россия

²Лаборатория Леона Бриллюэна, CEA/Saclay, France

³Санкт-Петербургский филиал Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН,

Методом малоуглового рассеяния нейтронов исследованы гидрогели, синтезированные на основе сшитых сополимеров 2-гидроксиэтилметакрилата и функциональных мономеров (акриловая кислота или диметиламиноэтилметакрилат), обладающие эффектом памяти по отношению к целевому лекарственному веществу – цефазолину. Показаны различия в строении анионных, катионных и амфифильных гидрогелей и связь строения со способностью гидрогелей к влагопоглощению в отсутствие и в присутствии цефазолина. Определенные структурные особенности строения гидрогелей подтвердили условия проявления эффекта памяти по отношению к поглощению и выделению цефазолина.
ВВЕДЕНИЕ

Полимерные мембраны, содержащие функциональные группы, находят все большее применение в научно-технических разработках. Так, перфторированные мембраны обладают протонной проводимостью и уже используются в топливных элементах в энергетических установках транспортных средств. Разрабатываются полимерные первапорационные мембраны для эффективного разделения газов и жидкостей. Полимерные гидрогели, способные поглощать и удерживать большое количество влаги, находят применение в качестве носителей лекарственных веществ. Также нами исследуются иономеры с функциональными ионогенными группами, которые могут использоваться для получения полимерных мембран [1–5].

При лечении и профилактике офтальмологических заболеваний в качестве полимерного носителя используют гидрогелевые мягкие контактные линзы (МКЛ), насыщенные лекарственными веществами. Лечебные МКЛ локализуют зону действия лекарства в области роговицы глаза, через которую вещество поступает во внутренние структуры глаза. Одна из проблем, возникающих при применении лечебных МКЛ, заключается в недостаточной сорбционной емкости МКЛ по отношению к сорбируемым лекарствам. Это не всегда позволяет создавать в тканях глаза терапевтически эффективные концентрации лекарственного вещества. Решением проблемы, позволяющим увеличить сорбционную емкость МКЛ к лекарству, является синтез полимерных гидрогелей с памятью по отношению к целевому лекарственному веществу. Эффект памяти реализуется путем матричного синтеза полимера в присутствии лекарственного вещества, используемого в качестве темплата и экстрагируемого из полимера после завершения синтеза с последующей сорбцией новой порции лекарства в полученный гидрогель. Формируемая нанопористая структура гидрогеля при правильно выбранных условиях синтеза приводит к увеличению его сорбционной емкости и более медленному высвобождению лекарства. В англоязычной научной литературе полученные таким образом гидрогели называют “imprinted (впечатанные) hydrogels” [5–10].

В настоящей работе исследовано внутреннее строение новых полимерных гидрогелей, обладающих эффектом памяти, синтезированных на основе 2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА), сшивающего мономера метиленбисакриламида (МБАА) и мономеров, содержащих функциональные группы: акриловую кислоту (АК) – анионные группы; ди-метиламиноэтилметакрилат (ДМАЭМА) – кати-онные группы. В качестве модельного темплатного лекарственного вещества применяли цефазолин, антибиотик из группы цефалоспоринов, которые широко используются для лечения и профилактики инфекционных офтальмологических заболеваний. Синтез гидрогелей, их состав, исследование сорбции и десорбции раствора лекарственного вещества гидрогелями описаны в [5]. Катионные и амфифильные впечатанные (imprinted) гидрогели, по сравнению с обычными гидрогелями такого же химического состава, позволяют реализовать эффект памяти по отношению к цефазолину, что проявляется в повышенной величине сорбции антибиотика за счет особой морфологии гидрогеля, возникающей при его синтезе [5]. Предварительные исследования гидрогелей, насыщенных водой, проведены в [11].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследованы образцы трех типов: I (с анионными группами), II (с катионными группами), III (амфифильные, содержащие и катионные и анионные группы). Каждый образец был в виде обычном (I, II, III – синтезированные без цефа-золина) и imprinted (I', II', III' – синтезированные в присутствии цефазолина).

Исследование структуры полимерных гидрогелей проводили методом малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) на установке PAXE (Лаборатория Леона Бриллюэна, г. Сакле, Франция) в диапазоне величин вектора рассеяния q = (4rc/A,)sin(0/2) = 0.004–0.3 Å^–1, где X = = 4–12 Å – длина волны, 9 – угол рассеяния нейтронов. Поскольку полимерные сетки содержат значительное количество водорода, вносящего в рассеяние некогерентный вклад, для расшифровки структуры гидрогелей использовали метод изотопного водородно-дей-териевого контрастирования, основанного на большой разнице в амплитудах когерентного ядерного рассеяния для водорода и дейтерия [12]. С этой целью высушенные на воздухе до постоянной массы образцы насыщали тяжелой водой (D₂O), погружая их в тяжелую воду, до состояния равновесного набухания в течение длительного времени (не менее 24 ч) и сравнивали их с образцами, набухшими в легкой воде (H₂O) при тех же условиях, а также с сухими образцами (высушенными на воздухе не менее 24 ч) и образцами, насыщенными тяжеловодным раствором цефазолина.

Таким образом, были исследованы четыре серии образцов: D – насыщенные D₂O; C – насыщенные раствором цефазолина 9.5% в D₂O; H – насыщенные H₂O; dry – сухие, высушенные на воздухе.

Степень набухания (S) рассчитывали по формуле


где Ww – масса влажного образца;

Wd – масса сухого образца. Для оценки набухания образцовтакже использовали величину их влагосодержания (С_w):



Толщина образцов d была выбрана в соответствии с предварительными измерениями образцов, насыщенных легкой водой, проведенными в ПИЯФ [11], и составила для серий D и С – два слоя (1.5–2 мм), для серий H и dry – один слой (0.6–1 мм). Толщину учитывали при калибровке сечений на абсолютные единицы (на см³ объема гидрогеля), которую проводили по прямым измерениям падающего пучка с использованием слоя графита в качестве аттенюатора [13].

В табл. 1 приведены параметры набухания образцов. Образцы серий D, С и H готовились из сухих пластинок выдерживанием их в соответствующем растворителе не менее суток. Для серии dry использовали исходные высушенные образцы (сушили на воздухе не менее суток). Толщины образцов D, C и H определяли прямыми измерениями, а для сухих образцов вычисляли из параметров набухания образцов в H₂O по формуле


где первое слагаемое – функция Гинье с радиусом инерции R_g1, которая описывает малоугловые части кривых, затем – функция Лоренца, описывающая рыхлые полимерные объекты с радиусом R_g2, затем – квадрат функции Лоренца, описывающий плотные объекты с радиусом R_g3, и некогерентный фон B. Примеры кривых рассеяния показаны на рис. 1 для образца I в различных состояниях. Результаты аппроксимации представлены в табл. 2.

Из анализа данных следует, что образцы II и II' (катионные) в насыщенном состоянии (H₂O, D₂O и раствор цефазолина) являются более рыхлыми (в них параметры C₂ и R_g2 преобладают над остальными), чем образцы I и I' (анионные) и III и III' (амфифильные).

Анионные образцы (I и I') в присутствии цефа-золина набухают значительно сильнее, а рост интенсивности рассеяния наблюдается на средних и больших углах, в малых углах она, наоборот, спадает. Из обработки видно, что доля и размеры плотных объектов, характеризуемых квадратом функции Лоренца, сильно уменьшается. Это значит, что в присутствии цефазолина вода в анионных

Та б л и ц а 1 . Параметры набухания образцов

Образец	Wd, г	Ww, г	S	г	d, мм
I D	0.2722	0.4540	0.668	0.400	1.78
I C	0.2808	0.5967	1.125	0.529	1.58
I H	0.1403	0.2400	0.711	0.415	0.78
I dry	-	-	-	-	0.65
I' D	0.3222	0.5335	0.656	0.396	1.79
I' C	0.3350	0.8069	1.409	0.585	1.74
I' H	0.1646	0.2972	0.806	0.446	0.93
I' dry	-	-	-	-	0.76
II D	0.2983	0.5518	0.850	0.459	1.51
II C	0.2458	0.4530	0.843	0.457	1.51
II H	0.1801	0.3369	0.871	0.465	0.87
II dry	-	-	-	-	0.71
II' D	0.3419	0.6501	0.901	0.474	1.75
II' C	0.3633	0.6538	0.800	0.444	1.85
II' H	0.1548	0.3149	1.034	0.508	0.82
II' dry	-	-	-	-	0.65
III D	0.3007	0.4994	0.661	0.398	1.65
III C	0.2978	0.5752	0.931	0.483	1.97
III H	0.1542	0.2664	0.728	0.421	0.80
III dry	-	-	-	-	0.67
III' D	0.3814	0.6606	0.732	0.423	1.77
III' C	0.3963	0.7311	0.845	0.458	1.88
III' H	0.1697	0.3115	0.836	0.455	0.85
III' dry	-	-	-	-	0.69

образцах распределяется по объему гидрогеля более равномерно.

Для катионных образцов, насыщенных тяжелой водой, при переходе от обычного образца к imprinted (II D → II' D) наблюдается сильный рост интенсивности рассеяния на малых углах. В меньшей степени этот эффект выражен для образцов II и II', насыщенных H₂O, это подтверждается измерениями и на установке “Мембрана-2” (ПИЯФ, г. Гатчина) [11]. Аппроксимация кривых рассеяния показывает, что при этом количество и размеры рыхлых объектов, описываемых функцией Лоренца, значительно уменьшается за счет увеличения объектов, описываемых функцией Гинье, которые могут быть более плотными. При приблизительно одинаковой степени набухания это означает, что в объеме образца II D вода распределена более равномерно, а в объеме образца II' D она формирует плотные образования.

Из кривых рассеяния с помощью программы gnom пакета ATSAS [14] (фурье-преобразование кривых рассеяния с переходом к прямому пространству) восстановлены корреляционные функции в сферическом представлении, которые описывают корреляции плотности длины когерентного рассеяния в сферических слоях радиуса R вокруг выбранной точки.

Та бл и ца 2 . Параметры аппроксимации кривых рассеяния по модели (3)

Образец	С1, см 1	Rg1, Å	С2, см–1	Rg2, Å	С3, см 1	Rg3, Å	В, см 1
I D	2680 ± 170	768 ± 8	0.528 ± 0.005	8.17 ± 0.15	4500 ± 1500	510 ± 50	1.109 ± 0.006
I' D	3350 ± 120	745 ± 5	0.821 ± 0.006	7.76 ± 0.11	3646 ± 35	500	1.006 ± 0.008
II D	0.64 ± 0.04	42.2 ± 1.2	75 ± 24	480 ± 90	1.056 ± 0.010	4.19 ± 0.09	0.774 ± 0.016
II' D	165 ± 10	532 ± 9	8.8 ± 0.6	123 ± 6	1.144 ± 0.007	5.02 ± 0.07	1.258 ± 0.010
III D	11.8 ± 1.8	367 ± 25	0.3272 ± 0.0024	4.04 ± 0.06	1.74 ± 0.27	60.0 ± 3.8	1.3
III' D	10.1 ± 1.5	336 ± 19	-	-	3.81 ± 0.08	60	2.1238 ± 0.0010
I C	531 ± 14	484 ± 4	1.30 ± 0.03	4.44 ± 0.12	14.2 ± 0.4	63.9 ± 0.8	1.14 ± 0.04
I' C	873 ± 26	523 ± 4	2.929 ± 0.014	11.70 ± 0.08	29.8 ± 0.7	70.0 ± 0.8	1.750 ± 0.005
II C	0.35 ± 0.05	48.0 ± 2.5	60 ± 10	370 ± 40	0.607 ± 0.007	4.55 ± 0.12	1.217 ± 0.010
II' C	71 ± 8	496 ± 14	9.54 ± 0.2	200	0.563 ± 0.023	2.86 ± 0.12	1.170 ± 0.026
III C	6.5 ± 1.6	380 ± 50	0.678 ± 0.026	3.54 ± 0.12	2.3 ± 0.4	73 ± 5	0.624 ± 0.028
III' C	4.1 ± 1.7	370 ± 70	-	-	0.6 ± 0.3	66 ± 12	1.3524 ± 0.0009
I H	172 ± 14	510 ± 12	-	-	7.3 ± 1.1	98 ± 5	1.8025 ± 0.0008
I' H	182 ± 12	491 ± 8	–	-	2.1 ± 0.3	65 ± 4	2.1348 ± 0.0009
II H	5.0 ± 0.7	263 ± 19	0.82 ± 0.11	54 ± 5	-	-	1.8329 ± 0.0014
II' H	13.1 ± 1.3	293 ± 11	0.46 ± 0.04	34.4 ± 2.5	-	-	2.4330 ± 0.0020
III H	15 ± 6	470 ± 60	-	-	1.31 ± 0.26	61 ± 5	2.0692 ± 0.0009
III' H	5.7 ± 0.7	242 ± 14	-	-	0.65 ± 0.08	32.5 ± 2.0	2.3500 ± 0.0011
I dry	16.7 ± 2.6	398 ± 18	-	-	-	-	1.2661 ± 0.0007
I' dry	14.6 ± 1.9	363 ± 15	-	-	-	-	1.2998 ± 0.0006
II dry	13.8 ± 2.0	378 ± 17	-	-	-	-	1.0766 ± 0.0006
II' dry	16 ± 3	408 ± 20	-	-	-	-	1.6429 ± 0.0008
III dry	9.7 ± 1.8	365 ± 22	-	-	-	-	1.3196 ± 0.0007
III' dry	14 ± 3	418 ± 27	-	-	-	-	1.6443 ± 0.0008

АНАЛИЗ КОРРЕЛЯЦИОННЫХ ФУНКЦИЙ ОБРАЗЦОВ В РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ

Корреляционные функции качественно подтверждают сделанные аппроксимации. На рис. 2 показаны корреляционные функции для образца I, а для образца I' они имеют аналогичный вид. Корреляции на малых расстояниях для образцов I и I' здесь проявлены слабо из-за сильных корреляций на больших расстояниях. Для образцов серий D и С наблюдаются корреляции на расстояниях 500–800 Å (при этом наличие цефазоли-на значительно ослабляет корреляции и для обычного образца, и для imprinted), для серий H и dry – 300–600 Å. Интенсивность корреляций для сухих образцов и насыщенных водой намного ниже, чем у насыщенных тяжелой водой и раствором цефазолина в D₂O, что связано с более низким контрастом рассеяния нейтронов на полимерных звеньях по отношению к легкой воде.

Корреляции катионного образца II (рис. 3) в состояниях C и D не сильно различаются. Средний радиус корреляций – около 400 Å, а интенсивность корреляций в присутствии цефазолина немного повышается. В отличие от анионных образцов, здесь хорошо проявлены корреляции на малых размерах, порядка 10 Å, видимо, характеризующие межцепные расстояния или расстояния между отдельными звеньями полимера. Интенсивность корреляций на малых размерах заметно понижается в присутствии цефазолина.

В образце II' также наблюдается узкий пик в области малых размеров для образца в состояниях D и C (рис. 4). В области больших размеров цефа-золин сильно ослабляет корреляции и снижает их средний размер с 500–600 Å до 400–500 Å. При одинаковой степени набухания это может означать, что раствор цефазолина распределяется в образце намного более равномерно, чем просто тяжелая вода, которая видимо не способна в отсутствие цефазолина распределяться равномерно и формирует более крупные образования в объеме гидрогеля. В отличие от II', для образца II этот эффект почти не выражен. Для образцов I и I', где также наблюдается сильное снижение корреляций в состоянии C, он выражен еще сильнее (рис. 2), если учесть, что и степень набухания в растворе цефазолина для этих анионных образцов больше ∼ в 1.5 раза, чем без цефазолина.

В образце III наблюдаются корреляции и на малых и на больших расстояниях (рис. 5). Интенсивность корреляций на больших расстояниях и их средние размеры заметно понижаются в присутствии цефазолина. Корреляции на малых расстояниях для состояний D и C выражены очень хорошо.


В образце III' корреляции на малых расстояниях явно не выражены на фоне корреляций на больших расстояниях (100–500 Å), а присутствие цефазоли-на значительно ослабляет интенсивность корреляций на больших расстояниях (рис. 6).
СОПОСТАВЛЕНИЕ КОРРЕЛЯЦИОННЫХ ФУНКЦИЙ РАЗНЫХ ОБРАЗЦОВ В ОДНОМ СОСТОЯНИИ

При насыщении D₂O образец I' показывает заметно большую интенсивность корреляций по сравнению с образцом I (рис. 7). Средние размеры корреляций у них совпадают около 800 Å, корреляции на малых расстояниях не проявлены. Остальные образцы имеют корреляции, значительно меньшие по интенсивности. Среди них выделяется образец II' со средними размерами около 500 Å, также имеющий узкий пик корреляционной функции в области малых размеров ∼10 Å. Образец II имеет значительно менее интенсивные корреляции на средних расстояниях 300– 400 Å. Корреляции на малых расстояниях у образцов II и II' совпадают. Образец III' отличается от образца III смещением корреляций в сторону меньших расстояний и слабо выраженными корреляциями на малых расстояниях.

Анионные образцы I и I', насыщенные тяжелой водой и раствором цефазолина, имеют похожий вид корреляционных функций, подобно состоянию D, со средними размерами корреляций около 600–700 Å (рис. 8). Катионные образцы II и II' имеют намного более слабые корреляции, а амфифильные III и III' – еще более слабые. При переходе от образца II к образцу II' наблюдается


умеренное повышение интенсивности корреляций и смещение их средних размеров от 300–400 Å к ∼500 Å, при этом наблюдаемые корреляции на малых расстояниях сохраняются. Корреляции в образце III' намного ниже по интенсивности по сравнению с образцом III в области всех размеров.

В состоянии, насыщенном легкой водой, анионные образцы также имеют корреляции значительно сильнее, чем остальные (рис. 9). В образце I' по сравнению с образцом I корреляции растут по интенсивности и смещаются от ∼300 Å к ∼ 400 Å. В образце II' корреляции также растут по сравнению с II, а для образца III' по сравнению с III наблюдается похожая картина в области размеров до 300 Å. Для образцов II, II', III, III' наблюдаются корреляции в малых размерах (10–20 Å), а в области больших размеров имеем периодичность корреляционных пиков около 100 Å, что отвечает упорядоченному расположению пор внутри образцов.

В сухом состоянии только образец I немного выделяется по интенсивности и средним размерам корреляций, остальные образцы не очень сильно различаются, хотя прослеживается закономерность – все впечатанные (imprinted) образцы показывают корреляции слабее, чем обычные (рис. 10). Во многих образцах прослеживается та же периодичность, что и в серии H. Наблюдается особенность в области малых размеров – все образцы имеют узкий отрицательный пик ∼20 Å, что характеризует межцепное расстояние или расстояние между звеньями.
ВЫВОДЫ

1. Ионный характер гидрогелей – анионный, катионный или амфифильный –определяет уровень водопоглощения гидрогеля.

2. Наличие цефазолина в составе гидрогеля усиливает влагопоглощение гидрогеля. Этот эффект усиливается для образца imprinted по сравнению с обычным образцом такого же химического состава.

3. Структура гидрогелей всех типов характеризуется малыми объектами до 10 Å и образованиями больших размеров, до 1000 Å. В анионных гидрогелях малые объекты проявлены плохо на фоне больших. Структура катионных гидрогелей в насыщенном состоянии более рыхлая, чем анионных и амфифильных (больше рыхлых, меньше плотных объектов).

4. Синтез впечатанных (imprinted) гидрогелей (в присутствии цефазолина) для анионного и катион-ного гидрогелей приводит к дополнительному упорядочению внутренней структуры, что ведет к формированию большего количества крупных образований при набухании. В амфифильных гидрогелях

для впечатанных образцов наблюдается более однородная внутренняя структура, с меньшим количеством крупных образований по сравнению с обычным образцом такого же химического состава. Это обстоятельство может иметь значение для практического применения гидрогелей.

Благодарим Лабораторию Леона Бриллюэна (LLB, France) за предоставленное экспериментальное время и J. Teixeira и S. Combet за помощь в проведении нейтронных экспериментов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Иванчев С.С., Лихоманов В.С., Примаченко О.Н. и др. // Мембраны. 2012. Т. 2. № 1. С. 3.

2. Патент РФ 2211725, 10.09.2003. Кононова С.В., Кузнецов Ю.П., Иванова В.Н. и др.

3. Лебедев В.Т., Торок Д., Мельников А.Б. и др. // Поверхность. Рентген., синхротр. и нейтрон. исслед. 2009. № 8. С. 16

4. Евмененко Г.А., Будтова Т.В., Буянов А.Л. // Поверхность. Рентген., синхротр. и нейтрон. исслед. 1999. № 3. С. 29.

5. Павлюченко В.Н., Иванчев С.С., Примаченко О.Н. и др. // Высокомолекулярные соединения. Сер. А. 2011. Т. 53. № 4. С. 560.

6. Cunliffe D., Kirby A., Alexander C. // Adv. Drug Del. Rev. 2005. V. 57. P. 1836.

7. Alvarez-Lorenzo C., Concheiro A. // J. Chromato-graphy. B. 2004. V. 804. P. 231.

8. Ali M., Horikawa S., Venkatesh S. et al. // J. Control. Release. 2007. V. 124. P. 154.

9. Alonso M.J., Sánchez A. // J. Pharm. Pharmacol. 2003. V. 55. P. 1451.

10. Hiratani H., Fujiwara A., Tamiya Y. et al. // Biomateri-als. 2005. V. 26. P. 1293.

11. Kulvelis Yu.V., Lebedev V.T., Trunov V.A. et al. // Crystallography Reports. 2011. V. 56. №. 7. P. 30.

12. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986. 280 с.

13. T e i x e i r a J . // Structure and Dynamics of Strongly Interacting Colloids and Supramolecular Aggregates in Solution. / Eds. Chen S.-H., Huang J.S., Tartaglia P. Dordrecht: Kluwer, 1992. P. 635.

14. Svergun D.I. // J. Appl. Crystallogr. 1992. V. 25. P. 495.

Investigation of Polymer Hydrogels with Memory Effect, for Cefazoline Immobilization, by Small-Angle Neutron Scattering

Yu. V. Kulvelis, V. T. Lebedev, V. A. Trunov, S. S. Ivanchev, O. N. Primachenko, S. Ya. Khaikin

Hydrogels synthesized on the base of cross-linked copolymers of 2-hydroxyethylmethacrylate and functional monomers (acrylic acid or dimethylaminoethylmethacrylate) with a memory effect to target medicine (cefa-zoline) were studied by small-angle neutron scattering. Differences in structure of anionic, cationic and am-phiphilic hydrogels were shown, as well as their relationship with water absorbance ability in the absence and in the presence of cefazoline.